免疫学技术
中和试验 将抗体与毒素或病毒结合，使毒素失去毒性或使病毒失去传染力的免疫学试验。可用以辅助诊断疾病，或鉴定病毒、某些未知病原体和毒素等。能在动物、鸡胚或组织培养中进行。 毒素中和试验 检定外毒素或抗毒素的技术。通常将一定量的一方(如外毒素)与递增稀释度的另一方（如抗毒素）混合，接种于适当的动物体，然后观察动物的死亡情况。如果毒素过多，可以引起特殊的症状与死亡。如果抗毒素过量，动物则不发生任何可见的反应。以半数动物的存活情况定出中和指数。 病毒中和试验 用于检查患过某些病毒疾病或免疫机体血清中抗体的增长情况的方法。也可用于鉴定病毒和研究抗原结构。一般用不同稀释度血清与定量病毒等量混合，放置一定时间，然后接种到细胞培养管中，每天观察细胞病变，以能抑制细胞病变的血清最高稀释度作为终点效价。这一试验多采用细胞培养，比动物和鸡胚试验经济而方便。中和抗体特异性高，维持时间较长，是流行病学调查常用的方法。 抗链球菌溶血素 “O”试验 中和试验的一种。有的细菌能产生溶解红细胞的毒素，如乙型溶血性链球菌能产生溶解人或兔红细胞的链球菌溶血素“O”。因其抗原性强，能刺激机体产生相应抗体，当该毒素遇到相应抗体时，则被中和而不出现溶血。目前临床诊断风湿病所用的抗“O”试验,就是用以测定患者血清中链球菌溶血素“O”抗体的中和试验。如果这种抗体在患者血清中高于正常值，即表明患者不久前或目前有溶血性链球菌感染。 抗血清的制备 含有某类具特异性免疫功能的抗体分子的血清制备。一般为给动物人工注射某类抗原后所制备的动物血清。常用的动物有马、羊、兔、猪、豚鼠和小鼠等。高效价的抗血清用于疾病的预防、诊断和治疗，或作为研究工作的手段。注射抗原时加入佐剂，可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间。实验室常选用家兔制备抗血清。 皮肤试验（皮试） 借助于抗原与抗体或抗原与致敏淋巴细胞在皮肤的反应而进行诊断的免疫学试验。根据反应机制可把皮试分为下述两大类： 中和反应的皮肤试验 例如锡克氏试验系白喉毒素皮内试验法，用以调查人群对白喉有无免疫力。其方法是：用一定量白喉毒素注射到受试者前臂的皮内，如于24～28小时后局部红肿，直径达1～2厘米，即为阳性反应，表明受试者没有免疫力；如果局部不出现红肿，则为阴性反应，表明受试者血清中含有足够量的抗毒素抗体，能中和注入的毒素，因而有免疫力。又如狄克氏试验是用链球菌红斑毒素作皮肤试验，用以测定对猩红热有无易感性。 超敏反应的皮肤试验 分迟发型和速发型两种： 迟发型超敏反应皮试 体内测定病人细胞免疫的重要方法。阳性者在抗原注入皮肤后48～72小时内，局部呈现红肿。常用的生物性抗原是由病原体提制的抗原，如结核菌素、白色念珠菌素、皮肤毛癣菌素、链激酶－链道酶、腮腺炎病毒皮试抗原等。此法的优点，是受试者可能在过去接触抗原的过程中已被致敏，检查时可以直接进行皮试，不需要致敏的过程。缺点是受试者过去接受抗原的量与时间不同,即致敏情况不同,因而皮肤反应个体差异大，往往对同一受试者须同时用多种抗原进行皮试，才能判断其细胞免疫功能。常用的化学抗原为2，4-二硝基氟苯(DNFB)。用这类抗原作皮试的优点,是可使大批受试者同时接受等量的从未接触过的抗原刺激，便于比较个体间的差异，测出机体细胞免疫应答的整个环节；其缺点是皮试前必须有2～3周的致敏过程，所需时间过长，而且会引起强烈的反应。这类抗原不宜用于儿童。此外，也用植物血凝素(PHA)作皮试,以测定人体的细胞免疫功能。 速发型超敏反应皮试 用于测定病人的体液抗体，尤其是lgE。例如,在注射青霉素或抗血清进行治疗之前，先把小量稀释的制剂注射到病人皮内，如果病人体内有参与过敏反应的lgE,10～30分钟注射处即呈现红肿，为阳性反应。这一试验原理可用于检测速发型超敏反应(变态反应)的变应原。 细胞免疫测定法 用体内试验和体外试验测定细胞免疫功能的方法。体内试验主要是作皮试，测定迟发型超敏反应（见上节皮肤试验），常在诊断肿瘤或免疫缺陷病时使用。体外试验的方法有淋巴细胞分离技术、淋巴细胞转化试验、巨噬细胞抑制试验、玫瑰花结形成试验（包括总数 E玫瑰花结试验）、吞噬试验、四唑氮蓝试验、嗜硷粒细胞脱粒试验、淋巴细胞毒性试验以及组织定型试验和组织配型试验等。 细胞分离技术 细胞免疫试验中，从血液或免疫系统器官中提取所需细胞的技术。20世纪70年代发展起来的激发荧光细胞分类技术是借助荧光激发细胞分离器，从周围的血中直接分离和收集所需要的不同种类的细胞，如粒细胞、淋巴细胞和血小板等。由于每种细胞对荧光素的结合不同,所以可用激光束照射单行流动的细胞,以激发荧光。然后收集聚焦后的荧光，用以测量细胞结合荧光素的多少，再收集经过含细胞微滴的激光，测量细胞的大小。利用光电效应,可使微滴带上不同的电荷,通过电场，细胞即能高速度、高纯度地分开。这一技术不仅能区别淋巴细胞及其亚类，而且可对正常血细胞、白血病细胞、神经系统的细胞、培养的正常细胞和培养的肿瘤细胞进行区分。 其他的细胞分离技术很多，其原理不外是利用各种细胞在理化性质、表面标记和细胞功能等方面的差别，将不同的细胞分开。淋巴细胞和部分粒细胞留在上清部分。在出现红细胞与血浆的界面时，血浆层底部含有丰富的淋巴细胞。若在抗凝的全血中加入葡聚糖或明胶，可促进红细胞聚集，加速红细胞下沉。另外一个方法是梯度离心法，利用聚蔗糖－泛影葡胺分层液，它的比重(1.077)小于红细胞和粒细胞而大于淋巴细胞,它的粘度适合红细胞和粒细胞的聚集。在试验时，先将抗凝血放在分层液的液面上，然后用适当的速度离心，淋巴细胞与单核细胞即沉积于分层液与血浆的界面（其中淋巴细胞占80％以上），其他细胞则沉落管底。 在分离淋巴细胞的亚群（T细胞和B细胞）时，常使用本文后面介绍的E玫瑰花结和EAC玫瑰花结技术。 淋巴细胞转化试验 T细胞在体外培养时,受到非特异性有丝分裂原（如植物血凝素、美洲商陆）或特异性抗原（如结核菌素、纯蛋白衍化物）刺激后，可转化为淋巴母细胞并进行有丝分裂。转化的淋巴母细胞不仅呈现不成熟的母细胞形体（胞体变大、细胞浆丰富、细胞核内核仁清晰可见），而且呈现蛋白质和核酸合成的增加，还合成并释放淋巴毒素、移动抑制因子等淋巴因子。现在我们可以采取形态学的方法，或者以3H标记胸腺嘧啶掺入量的增加来判定淋巴细胞的转化率。 目前常用的以植物血凝素刺激淋巴细胞转化的试验是非特异性的，转化率的高低只反映病人总的细胞免疫功能。正常人的转化率约为70％左右。用结核菌纯蛋白衍化物进行淋巴细胞的转化试验，是以特异性抗原去刺激被结核菌蛋白致敏过的T细胞发生转化,转化率一般为5～30％，它既能反映机体的总的细胞免疫功能,又能反映人体对这种特异性抗原的细胞免疫情况。淋巴细胞转化试验可用于测定结核、布氏杆菌病、慢性肝炎等传染病的细胞免疫功能，判断肿瘤的疗效和预后。 巨噬细胞移动抑制试验 一种特异性细胞免疫测定法。当致敏淋巴细胞在人工培养条件下再次遇到同样抗原时，或其他一些非特异性有丝分裂原，如植物血凝素、美洲商陆、刀豆素A等,都可激发淋巴细胞产生移动抑制因子，此种因子能够抑制巨噬细胞或中性粒细胞的移动。通过测定移动抑制的程度，可以了解机体内的细胞免疫状态。在一般情况下，这种体外特异性移动抑制试验的结果,往往与迟发型变态反应皮肤试验相一致。目前,这一试验已应用于检测肿瘤、器官移植和自身免疫性疾病。 玫瑰花结试验 利用细胞吸附的原理测定细胞表面受体的方法。因具有相应结构的某些细胞可吸附在淋巴细胞周围，形成玫瑰花的形状而得名。 在人体外周血的淋巴细胞中，T细胞和B细胞的表面受体有所不同，前者具有与绵羊红细胞结合的受体，后者约90％具有C3受体，能与补体结合。根据这种不同的表面标志，可将外周血中的T细胞和B细胞区别开。 E玫瑰花结试验 人的T细胞表面有绵羊红细胞的受体，它是一种糖蛋白，能与绵羊红细胞表面糖肽相结合。将被检的淋巴细胞与绵羊红细胞悬液，在一定条件下混合孵育后再染色镜检,可见到许多吸附有绵羊红细胞(至少3个以上)的淋巴细胞（T细胞）呈玫瑰花状，称E玫瑰花结(红细胞玫瑰花结)。能形成 E玫瑰花结的不仅是人的T细胞，还有豚鼠、猪、狗和牛等动物的T细胞。除绵羊红细胞外，山羊、家兔、猪、马、狗、猩猩和猴等动物以及人的红细胞,均可作为E玫瑰花结的指示细胞。不同种系的淋巴细胞只能与某些种的红细胞结合形成 E玫瑰花结。 EAC玫瑰花结试验 补体、抗人（鸡、鸽、豚鼠、牛或羊）红细胞抗体和人（鸡、鸽、豚鼠、牛或羊）红细胞结合成EAC(E指erythrocyte,细细胞、抗体、补体)复合物。90％的人B细胞表面有补体受体，可以吸附EAC形成玫瑰花结。 EAC玫瑰花结用于测定外周血中具有补体受体的B细胞数，正常值为13～25％。但在慢性淋巴细胞白血病和全身性红斑狼疮患者的外周血中,EAC玫瑰花结形成的细胞增多；在患体液免疫缺陷病时，B细胞显著下降。 吞噬试验 用于观察机体免疫状态的试验。也可作为判断疗效的指标。体外法采全血（人、动物）或腹腔液（动物），用抗凝剂洗涤其中的吞噬细胞，加入细菌或其他颗粒（红细胞、胶体炭粒、聚苯乙烯球形颗粒），在37℃水浴中孵育一定时间，然后涂片染色，计算每个吞噬细胞中吞噬细菌（或其他颗粒）数目的平均值。由于人体取材困难，中国首先创用斑蟊酒精提取液刺激皮肤产生水泡，从中抽取含有大量巨噬细胞的渗出液，然后进行体外测定。 动物试验常用体内法，一般作炭粒清除，即由静脉注入胶体炭粒制剂，经过一定时间后取血检查剩余颗粒的浓度，并以血流清除炭粒的速度来说明单核吞噬细胞系统的吞噬活性。此外，还可采用注入类脂悬液、荧光颗粒、磷酸铬和用碘标记的蛋白等方法。 四唑氮蓝 (NBT)试验 测定中性粒细胞内杀菌功能的简单方法。中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗骤增，氧的消耗量增加，磷酸己糖支路糖代谢活力增强，葡萄糖分解的中间产物（6-磷酸葡萄糖），在此支路中氧化脱氢而成5-磷酸戊糖，所脱的氢原子被外加的四唑氮蓝接受，将浅黄色的氧化型还原成点状或块状的蓝黑色甲颗粒,沉积于中性粒细胞的胞浆中。这种细胞称为NBT阳性细胞或甲细胞。试验时，先采病人耳血，加入肝素抗凝，与NBT液混合孵育,然后离心、制片、染色镜检、观察计数。细菌性疾病的 NBT阳性细胞的百分数和总数明显高于正常，病毒性疾病的数值则与正常无异。因此，目前用此法鉴别细菌性疾病和非细菌性疾病。 嗜碱粒细胞脱粒试验 协助临床诊断速发型超敏反应的体外试验。血液中的嗜碱粒细胞和组织中的肥大细胞内部充满含有组织按、5-羟色胺等活性介质的颗粒，而表面上则存在有与过敏抗体FC段结合的受体，当过敏抗体结合到细胞表面上而使细胞致敏时，如果再加入相应的过敏抗原，两者结合可使细胞脱出颗粒并释放活性介质，从而引起速发型超敏反应。 过敏抗体有两类：一是过敏反应的lgE类抗体,能与大白鼠腹液中的肥大细胞结合;另一是过敏反应的lgG类抗体，可与家兔血中嗜碱粒细胞结合。 试验方法有①直接法：取病人外周血中的嗜碱粒细胞,加上可疑的相应抗原；②间接法:用家兔血中的嗜碱粒细胞或大鼠腹腔液中的肥大细胞，加上病人的血清和可疑的相应抗原。当过敏抗原与过敏抗体相结合时，细胞中的颗粒便被脱出。可用中性红或詹纳斯绿作超活体染色镜检，计算脱粒的细胞数，借以观察被试人血清中有无过敏抗体。 组织定型试验 在组织移植中，测定供者和受者有核细胞表面组织相容性抗原的种类及其相容程度的方法。在同种异体间进行组织或脏器移植之前，先作组织相容性抗原（人白细胞抗原HLA）的检查,了解供者与受者之间的组织相容程度，选择最合适的供者，可提高移植的成功率。 微量淋巴细胞毒试验 用已知的单价 HLA抗原特异性抗血清测定淋巴细胞表面是否具有相应的 HLA抗原的方法。先使细胞、抗体和补体在一定温度条件下作用一定时间，然后检查细胞的活存数。将供者和受者的淋巴细胞分别加入标准的抗HLA血清，再加入家兔的补体,然后加入伊红染料镜检。如果淋巴细胞肿大,染成深色,呈现死亡状态,即表示该淋巴细胞具有这种HLA抗原。反之，如果淋巴细胞未被杀死，活存细胞保持着较小体形，呈光亮的正常形态,即表示不含有该种HLA抗原。在进行交叉配型时，可采用同样的操作方法，给供者的淋巴细胞加入受者的新鲜血清（抗HLA血清）,如果受者的血清使供者的淋巴细胞死亡，即表明受者的血清中存在抗供者的组织细胞抗体，供者和受者之间的组织相容性程度差，不能选作移植供者。 组织相容性配合试验 测定受者与供者组织相容性抗原总量有无差异或相似程度的方法。体外试验应该采用混合淋巴细胞培养的方法。双向法是将供者和受者的淋巴细胞混合培养，如果二者的组织相容性抗原不相容，就会发生相互间的刺激，使双方淋巴细胞出现母细胞转化。单向法是将供者的淋巴细胞先用丝裂霉素或 X射线处理，使其失去转化和合成DNA的能力,但仍保持能够刺激对方细胞发生转化的抗原特异性，然后，将处理过的供者淋巴细胞与未处理过的受者淋巴细胞混合培养，如果出现转化，即为阳性反应，表明二者的组织相容性抗原不相符合。凡有亲缘关系的，呈弱阳性反应；凡是组织相容性抗原有很大差异的，呈强阳性反应。 标记免疫技术 用各种标记物标记抗原（或抗体），测定相应的抗体（或抗原）的方法。这种技术具有高度敏感性和特异性，因而得到广泛应用。根据标记方法的不同，主要分为荧光抗体技术（在抗体上标记荧光色素）、放射免疫测定（在抗原或抗体上标记放射性同位素）和酶联免疫吸附试验（在抗原或抗体上结合适当的酶）。荧光抗体技术和放射免疫测定虽然应用较广，但又各有缺点：前者操作时间长，肉眼观察结果不可靠，也不能定量和自动化；后者自动化设备价格太高，放射性同位素试剂的半衰期很短，而且会危及人体的健康。酶联免疫吸附试验具有上述两法的优点而无其缺点，是一种敏感、快速而简便的方法。 荧光抗体技术 以荧光色素标记抗体，制备成荧光抗体（简称FA），然后用这种荧光抗体涂染被检查的标本，再以紫外线光源的荧光显微镜进行检查。如果见到有发出荧光的抗原抗体反应物，即表明标本中有与荧光抗体相对应的抗原而被荧光抗体着染。这一技术的操作有直接和间接两种方法：直接法是以荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原结合，用于检测未知的抗原；间接法是将未标记的抗体与相应抗原结合起来，再加上用荧光素标记的抗抗体，形成抗原-抗体-荧光抗抗体复合物，用于检测未知的抗原或抗体。因为间接法所用标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，能与所有的同种属的抗体结合，所以比直接法方便，而且敏感性高。 利用此项技术可以比较准确、迅速、敏感地测出少量抗原、抗体以及抗原－抗体复合物在细胞内或组织内的定位和分布。此项技术已应用于免疫学、细菌学、病理学、肿瘤学的基础理论研究以及临床快速诊断(图5) (责任编辑：laiquliu) |
