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（二）实验方法 1、样品制备 酶细胞化学的一个重要问题是既要保存好细胞内酶的活性，又要保存好细胞的结构，因此选择适当的固定剂种类、浓度、固定的方式和时间是细胞化学技术的一个关键问题。光镜样品固定多选用中性福尔马林或多聚甲醛,4℃、24小时，常规的石蜡包埋切片可以满足相当一部分酶的细胞化学要求；电镜样品固定通常用0.5～2％戊二醛或4％多聚甲醛,4℃、2小时，再切成5～100μm的厚片用于细胞化学反应，反应后经常规的锇酸后固定，脱水、包埋、超薄切片、至电镜下观察。冷冻切片能较大限度地保存酶的活性，因此是光、电镜酶细胞化学技术中常用的方法。 2、酶细胞化学反应 酶细胞化学反应实际上就是孵育反应的过程，孵育液的成分主要有酶的底物、捕捉剂，保证孵育液pH 的缓冲液以及有关的添加剂等。孵育的温度和时间可根据不同的酶和组织通过实验而确定。电镜酶细胞化学的样品在孵育反应后需经锇酸后固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋和超薄切片，至电镜下观察。 3、基本实验过程 光镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→ 冷冻切片 → 细胞化学反应 （酶反应＋捕捉反应）→ 光镜观察 电镜样品： 固定（酶固定＋结构固定）→切组织片→细胞化学反应 （酶反应＋捕捉反应）→脱水包埋→ 超薄切片→电镜观察 二、 免疫细胞化学技术 免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗原抗体特异结合的特性定位组织和细胞中特异大分子的一类技术。它包括光镜水平（简称免疫组化）和电镜水平(简称免疫电镜)的免疫细胞化学技术。应用免疫细胞化学技术可在原位检测细胞的各种大分子，如蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等。 （一）免疫细胞化学技术的原理 免疫细胞化学技术的原理是：把组织中的特异分子作为抗原，用各种在显微镜下 可见的标记物标记特异抗体或标记抗原抗体复合物，使特异的免疫化学反应具有可见性，从而间接地显示抗原，达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。 1． 抗原 用免疫细胞化学技术检测的分子可以是各种大分子，它们在这一技术中扮演抗原的角色。所以，细胞中的任何分子，只要其结构复杂到一定程度，具有免疫原性，能作为抗原或半抗原，从而能导致针对它的抗体产生，都能作为靶分子，用该技术得到检测。它们可以是蛋白质、多肽、核酸、多糖和磷脂等，最常见的待检分子是蛋白质、多肽。除了检测组织和细胞中天然存在的蛋白质、多肽，该技术还能检测在培养细胞中人为表达的重组蛋白质分子。方法是利用分子生物学技术制备重组DNA时导入一段序列，该序列编码一个多肽与重组蛋白质连接在一起，该多肽作为抗原或半抗原能导致针对它的抗体产生。当这一重组DNA在培养细胞中表达时，可以因为含有特异抗原或半抗原多肽，而能用免疫细胞化学技术检测到，因而重组蛋白质也就能在同处被检测到。免疫细胞化学技术的这种巧妙应用，近来在研究新克隆得到的蛋白质分子的定位中发挥很大作用，也为该技术开拓了更广阔的应用空间。 2． 抗体 单克隆和多克隆抗体，可从市售获得或自行制备。在免疫细胞化学技术中可以有 两个层次的抗体。针对抗原的抗体称为第一抗体，针对第一抗体的抗体称为第二抗体。 3．免疫细胞化学中的标记物 免疫细胞化学技术是用已知的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法，但抗原抗体相结合的复合物在显微镜下是看不见的，必须用特殊的标记物对抗体或抗原抗体复合物进行标记，才能使抗原抗体复合物在显微镜下具有可见性。常用的标记物有以下几种： ⑴ 荧光素 用荧光素标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合， 在荧光显微镜下检测荧光素所发荧光，便可知抗原的分布部位，常用的荧光素有绿色荧光的异硫氰酸荧光素和红色荧光的罗达明B200等。 ⑵ 酶 用酶标记已知抗体，再与组织或细胞中的相应抗原结合，利用酶细胞 化学方法显示该标记酶以达到显示抗原的目的。常用的标记酶如辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）与其底物H2O2和氨基联苯胺相遇时，形成的棕色沉淀可在光镜下观察到，遇锇酸反应后形成锇黑电镜下呈高电子密度。 ⑶ 胶体金 将胶体金与抗体结合形成金标记抗体，再与相应的抗原结合，形 成显微镜下可见的电子致密的金颗粒。常用的胶体金颗粒直径为5～60nm。 ⑷ 亲和物质 亲和物质是一种有多价能力的物质，不仅与另一种亲和物质有 高度的亲和力，而且可与抗体蛋白及各种标记物如荧光素、酶、胶体金等结合，因而可以通过荧光显微镜、酶加底物显色反应等定位某种特异分子。常用的亲和物质系统有生物素－亲和素系统、葡萄球菌A蛋白－免疫球蛋白系统。 ⑸ 铁蛋白 将铁蛋白通过一种低分子的双功能试剂与抗体相结合，它既保 留了抗体的免疫活性又具有显微镜下可见的高电子密度核心。 2、免疫细胞化学中的直接法和间接法 直接法：用标记的特异抗体直接检测相应抗原的方法称为直接法。 间接法：用未标记的特异抗体（第一抗体）与组织中的抗原结合，再用标记的第二抗体与第一抗体结合，间接检测组织中的抗原。这种方法因为在第一抗体上可以结合多个标记的第二抗体，所以其灵敏度比直接法更高. （二）实验方法 免疫细胞化学技术的实验方法包括标记抗体的准备、组织样品的制备及免疫细胞化学反应。 1、标记抗体准备 抗体标记的基本方法是利用分子间电荷等作用力或使用交联剂，将抗体与标记物连接在一起。但在绝大多数情况下，标记抗体从市场购得。 2、样品制备 样品固定时既要保存好组织细胞结构和抗原位置又要保存好抗原 性。常用的光镜固定剂为多聚甲醛，冷冻切片或常规石蜡包埋、切片；电镜样品多选用多聚甲醛与低浓度戊二醛（0.05～0.5%）混合液，锇酸损伤抗原性，不能在细胞化学反应前使用。电镜免疫细胞化学反应可在未经包埋的组织片上进行，称包埋前技术；也可在超薄切片上进行，称包埋后技术。此外，冷冻超薄切片可直接用于电镜免疫细胞化学反应。 3、基本实验过程 光镜样品 固定（抗原固定＋结构固定）→ 冷冻切片或石蜡包埋切片→ 免疫细胞化学反应→ 光镜观察 电镜样品（包埋前技术） 固定（抗原固定＋结构固定）→切组织片→免疫细胞化学反应→脱水包埋 →超薄切片→电镜观察 电镜样品（包埋后技术） 固定（抗原固定＋结构固定）→脱水包埋→超薄切片 →免疫细胞化学反应→电镜观察 三、放射自显影技术 放射自显影（radioautography）是利用放射性核素（同位素）的射线作用于感光材料的卤化银晶体，产生潜影，然后通过显影过程把“像”显示出来，以研究用放射性核素标记的物质在生物体内的定位和定量的一种技术。放射自显影技术有光镜和电镜两个层次。光镜放射自显影研究同位素标记物在组织和细胞中的分布；电镜放射自显影研究同位素标记物在细胞超微结构水平上的分布。 放射自显影技术通过标记大分子的前体（precursor）来示踪大分子代谢的过程，分析它们不同时期在不同组织、细胞或细胞器中被摄取、转运、贮存及排出的动态变化，从而在不破坏组织和细胞结构的情况下了解细胞、组织和器官的代谢状态，如用放射性DNA前体3H胸腺嘧啶核苷酸标记细胞了解DNA的合成情况等。另外，也可以将放射性核素联结到能与特异大分子结合的探针上，显示特异大分子的定位和定量，如用35S标记的脱氧胞嘧啶核苷参入探针DNA分子，通过原位杂交使这一放射性探针与特异DNA或RNA分子结合，再通过放射自显影显示特异核酸分子在组织或细胞内的分布。 (一) 放射自显影技术基本原理 放射自显影技术基本原理是：将放射性核素标记的物质引入生物体或细胞，参与细胞的正常代谢过程，或联结到能与特异大分子结合的探针上，利用放射性核素放出的射线作用于核子乳胶而显像，从而达到对该放射性物质在组织或细胞内定位的目的，因此，放射性核素对核子乳胶的作用是放射自显影技术的关键。 1、核子乳胶 核子乳胶是卤化银晶体在明胶中形成的悬浮体，颗粒细小而均匀，具较好的灵敏度，能精确地测定显影颗粒的密度、离子射程和径迹的扩散。 2、放射性核素放出的射线 放射性核素在进行蜕变时主要放出三种射线，α、β、和γ射线。三种射线都能对感光材料发生作用，但情况各不相同。β射线具有较大的穿透本领和较小的电离作用，在放射自显影技术中有重要意义，在组成生物大分子的主要元素中都有发射β射线的核素如3H、32P、33P和35S等，是放射自显影的重要工具。 3、射线对核子乳胶的作用 放射自显影的过程和普通的照相过程很相似。射线作用于核子乳胶时，带电粒子和卤化银发生作用，把卤离子的一个轨道电子击出，使其成为卤原子，而被击出的电子为卤离子周围的银离子所俘获，使银离子变成银原子。这就是潜影形成的过程，再经过显影和定影，影像就呈现出来。 （二）实验方法 放射自显影的主要步骤包括：放射核素的标记、样品制备、核子乳胶膜的制备、自显影和显影及定影等。现以电镜放射自显影为例作简单介绍。 1、放射性核素标记所要研究的大分子 含有放射性核素、用来示踪大分子的物质叫作示踪化合物。要研究大分子的代谢过程，所选择的示踪化合物必须是所研究大分子的前体。方法是给动物注射示踪化合物，或对培养细胞在培养液中加入示踪化合物。要研究已合成的大分子的定位，则可以通过酶促反应令示踪化合物参入探针，再通过原位杂交反应令放射性探针与所要研究的大分子结合。 2、样品制备 电镜放射自显影中的样品制备过程与普通样品制备技术相同。 3、涂覆核子乳胶膜 在带有放射性核素的切片上覆盖一层核子乳胶膜，然后进行自显影过程。制备乳胶膜需在暗室内安全灯光下进行。制备方法包括环套法、浸涂法、平基法等。 4、自显影过程（曝光） 自显影指在无光条件（暗盒内）下让切片中放射性核素发射出来的带电粒子和乳胶中卤化银晶体作用的过程。自显影过程一般在低温（4℃）和干燥的条件下进行。 5、显影和定影 经过带电粒子作用而在核子乳胶的卤化银晶体中所产生的潜影，必须经过显影和定影才能把“像”显示出来。显影的作用是使潜影变成不稳定的影像，而定影使已显影的影像稳定下来。 6、基本实验过程 用于大分子合成过程研究的放射自显影技术： 同位素标记示踪化合物→注入动物体内→ 取下器官或组织→切片→ 涂乳胶膜→自显影→显影和定影→染色→观察 用于大分子定位研究的放射自显影技术： 组织固定包埋→切片 ↓ 细胞化学反应→涂乳胶膜→自显影→显影和定影→染色→观察 ↑ 同位素标记示踪化合物 四、原位杂交技术 原位杂交技术（in situ hybridization）是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。 （一）原位杂交技术的原理 原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。 1、核酸分子杂交 DNA双链分子在一定条件下可以发生变性和复性的过程。分子杂交技术利用的就是两条互补的DNA单链能够复性的性质。分子杂交是碱基互补的两条异质核酸单链在一定条件下缔合形成双链分子的过程。这一过程相当于DNA的复性，只是核酸单链的来源不同。 原位杂交技术中，以经过标记的已知核酸分子为探针，以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子，造成一定条件使探针与靶核酸分子在原位发生杂交，然后再对其探测 。 2、探针标记 探针是经过标记的核酸分子，与待测DNA或RNA序列互补。探针主要有cDNA、RNA和寡核苷酸。 探针标记物有放射性的和非放射性的两类。常用的放射性标记物主要有35S、32P、33P和3H。非放射性标记物主要有荧光素、生物素、地高辛和溴脱氧尿嘧啶等。通常标记物被导入某个单核苷酸而形成标记分子，如四甲基罗达明-UTP、生物素-UTP、地高辛-dUTP等。然后通过各种酶促反应，如随机引物法或PCR法，使标记分子参入探针。 3、杂交 不同来源的序列互补的单链核酸分子在一定条件下借氢键相连而形成双链杂交分子的过程为杂交。杂交可发生于RNA与DNA、DNA与DNA、RNA与RNA之间。形成的双链杂交分子为杂交体（hybrids）。 4、杂交体的探测 对杂交体的探测根据探针标记物的不同而采用各种方法，目的是使标记的杂交体在光镜或电镜下可见。 ⑴ 放射自显影 如果探针是同位素标记的，显示杂交反应的方法就是光镜或电镜水平的放射自显影技术。方法是在切片上涂覆核子乳胶膜后置于暗盒中于4℃自显影一段时间，然后经显影和定影后观察银离子在细胞和细胞器分布情况。 ⑵ 免疫细胞化学 对于非同位素标记的探针，可根据免疫细胞化学原理用直接法或间接法将探针标记物显示出来。也就是采用那些在光镜或电镜下具有可见性的免疫细胞化学标记物来直接或间接地显示杂交探针标记物。如用地高辛标记探针杂交后，需加入碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体，再加入酶的底物来显示杂交体。 （二）实验方法 原位杂交技术的实验方法主要包括：标记探针的准备，组织样品制备，杂交和杂交体探测。 1． 标记探针的准备 对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择，要考虑 所要检测的靶核酸分子的性质，如cDNA 和RNA 适宜于检测mRNA分子，寡核苷酸对mRNA的杂交效率和特异性都不如RNA探针。 2．组织样品制备 光镜原位杂交标本的固定多使用4%多聚甲醛，常规石蜡包埋和切片，但在操作过程中应提防RNA酶污染。电镜原位杂交标本的固定也采用4%多聚甲醛。与免疫细胞化学技术一样，电镜水平的原位杂交可以在未经包埋的组织切片上进行，称包埋前技术；也可以在超薄切片上进行，称包埋后技术。冷冻切片能较好的保存靶核酸因而较易获得杂交信号，但对细胞结构的保存较差。 3． 杂交 杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记探针与组织中靶分子结 合的过程。杂交的效率和特异性是优化杂交条件的出发点，也是需要兼顾的两个方面。影响因素主要是探针的结构、杂交温度、杂交液中的甲酰胺浓度和离子强度、杂交后漂洗等。要通过实验对条件进行优化。 4． 杂交体探测 根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免疫细胞化学 方法显示杂交结果。 5． 基本实验过程 探针标记→纯化→(变性) ↓ →涂覆乳胶→放射自显影 原位杂交→杂交体探测：→加酶联抗体→加酶底物显色 ↑ →金银染色 样品制备→切片→通透处理 第三节 细胞结构成分的离心分离技术 就像可以把细胞从组织中分离出来进行研究一样，人们也可以把细胞器从细胞中分离纯化出来，以研究它们各自特有的的化学组成、酶活性和代谢特点。尽管在一个世纪前就有人试图分离细胞器，但直到20世纪40年代有了超速离心机和细胞匀浆技术后，才真正建立了细胞器的分离技术。用这一技术可以获得相对纯净的各种细胞器和大分子颗粒。使用超速离心机是这一技术的关键，因此该技术称为细胞结构成分的离心分离技术。 要进行细胞结构成分的离心分离，需先破碎细胞，通常用渗透压休克、超声振荡或研磨等方法。破碎细胞的悬液称为匀浆，其中包含了核、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物体等多种膜包围的囊泡，还可以有内质网形成的囊泡－微体，它们各有特定的大小和密度，因此可以用高速或超速离心的方法分开。 (责任编辑：laiquliu) |
