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一．离心分离技术的基本原理和方法 （一） 离心分离的基本原理 用超速离心机分离各种细胞结构成分有多种方法，它们都是根据颗粒或分子在离心场中的运动原理来设计的。悬浮液中的颗粒在离心力场中的沉降速度除了与颗粒的质量有关外，还与颗粒的密度、体积以及悬浮介质的密度和粘度有关，悬浮液中颗粒或分子的沉降速度可用stokes公式来表示。 dX 2r2 ( ρp— ρΜ) ＝ g dt 9η 式中dX/dt为颗粒沉降速度，X为颗粒到转轴中心的距离，t为时间，r为颗粒直径，ρp为颗粒密度，ρΜ为介质密度，η为介质密度，g为作用于颗粒的离心力。从公式中可以看到，颗粒在离心力场中的沉降速度与颗粒对介质的密度差ρp-ρΜ有重要关系：当ρp>ρΜ时，沉降速度为正数，颗粒向管底沉降；当ρp<ρΜ 时，沉降速度为负数，颗粒向管上方移动；当 ρp =ρΜ 时，沉降速度为零，颗粒悬浮在介质中不移动。这一基本原理是差速离心和等密度区带离心方法的主要依据。 根据Stokes公式，如果在相同的离心力场中，不同颗粒的沉降速度只决定于r、ρp、ρM和η4个因素。在实际应用中,不必分别测定这4个因素的具体数值,而是用沉降系数s (sedimentation coefficient)来表示颗粒沉降的参数,即 2r2(ρp-ρM) s = 9η 式中s为沉降系数,它与颗粒直径、颗粒密度、介质密度和介质粘度有关,而介质密度和粘度又是恒定的,因此s主要与颗粒的大小与密度有关，是表示颗粒大小和密度的参数。沉降系数的单位以秒（s）表示,一般细胞结构成分的沉降系数介于1～200×10-13s之间，习惯上把10-13s作为沉降系数的单位(Svedberg unit)，简称S。如果一种颗粒的沉降系数是8S，就说明实际的沉降系数是8×10-13s，S值越大，颗粒的沉降速度越大。 把s代入Stokes公式，可以简化为 dX/dt s = g 这样，沉降系数就很容易在实验中测定了。 （二） 离心分离的基本方法 细胞结构成分离心分离的方法主要有两类，一类是利用颗粒大小的不同进行离心分离，当颗粒密度大于介质密度(ρp >ρM)时，离心时颗粒向管底移动，移动的速度主要取决于颗粒的大小，大颗粒沉降快，小颗粒沉降慢，这一类方法包括差速度离心(differential centrifugation)和移动区带离心(moving-zone centrifugation)；另一类是利用颗粒的密度不同进行离心分离，称等密度离心(isodensity centrifugation)。 1、差速离心法 差速离心法（diffrential centrifugation） 通过一系列递增速度的离心，将不同大小颗粒分离。先在低速离心条件下把大的颗粒沉降到管底，其它颗粒留在上清液中；然后以较高的速度离心，把较大的颗粒沉淀于管底。这样依次把不同大小的颗粒逐级分离。这种方法适用大小差别较大颗粒的分离，如各种细胞器的初步离心分离。 2、移动区带离心法 移动区带离心法（moving –zone centrifugation） 对于大小差别较小的颗粒,可用移动区带离心法分离。方法是将要分离的样品放在介质溶液表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，在最大的颗粒尚未到达管底时停止离心，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。这种方法必须注意离心时间,离心时间过长，所有颗粒都会沉到管底。经改进，用梯度蔗糖或甘油溶液(从管面到管底密度逐渐增高)作为移动区带离心的介质，可减少颗粒弥散，稳定颗粒的沉降,使形成的区带更明显，便于收集。在移动区带离心法中，介质的密度必须小于颗粒的密度。 3、等密度离心法 等密度离心法（isodensity centrifugation） 根据Stokes公式，当颗粒密度（ρp）等于介质密度（ρM）时，离心时颗粒悬浮于介质中不移动。等密度离心法就是根据这一原理进行的。采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，把要分离的样品放在密度梯度液表面或者混悬于梯度液中。通过离心，不同密度的颗粒或上浮或下沉，当到达与它们相同密度的介质区带时，颗粒不再移动，结果不同密度的颗粒位于各自的密度区，形成一系列区带。然后停止离心，从管底收集不同密度的颗粒。 二、细胞结构成分离心分离的实验方法 （一）实验条件的选择 （1）离心方法的选择 在进行细胞结构成分离心分离时，要根据研究对象选择离心方法。选择的依据主要是颗粒的大小和密度以及各种离心方法的特点。如果样品中颗粒的大小或沉淀系数差别很大，一般采用差速度离心方法就可达到分离的目的；如果颗粒大小差别较小，可用移动区带离心法；如果颗粒的大小差别不大而密度有差别，则应采用等密度离心法；如果两种颗粒的大小和密度都相似，就必须通过适当方法改变某种组分的性质，然后进行离心分离。另外，不同方法的特点也是考虑的因素，如差速离心法离心时间比等密度离心法短，而且所用介质浓度也比较低，对细胞结构成分的损伤和抽提都比较小，因此适用于细胞结构成分的分析分离；而等密度离心法在一定体积的介质中可以分离较多的细胞成分，适用于细胞结构成分的制备分离。 （2）介质材料的选择 理想的介质材料应该是：形成的溶液密度范围大、粘度低，对细胞结构成分损伤小，离心分离后容易去除，浓度容易测定等。常用的介质有蔗糖、甘油等亲水有机分子和氯化铯、硫酸铯等重金属盐。蔗糖和甘油溶液的最大密度是1.3×103kg/m3,能用来分离较低密度的膜性细胞器如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体等。重金属盐溶液的最大密度可达1.9×103kg/m3，可用来分离密度大于1.3×103kg/m3的分子，如DNA、RNA、核糖体等。由于重金属溶液密度很大，在离心力场中会自动形成密度梯度，用来分离的物质可直接与重金属盐溶液混合，然后进行等密度离心。 （二）细胞器的分离 （1） 细胞器的释放 在分离细胞器之前必须破碎细胞、释放细胞器。破碎细胞的方法有低渗处理、超声振荡、冻融、用匀浆器打碎等多种细胞匀浆，但最常用的方法还是细胞匀浆，即采用机械方法破碎细胞使其匀浆化，滤去细胞碎片后制成细胞器悬液。 （2）细胞器的初步分离 用差速离心法分离各种细胞器。先用500～1000×g离心，使大的细胞组分沉降，沉淀中主要是细胞核，还包含一些细胞碎片；将第一次离心的上清液用10000～20000×g离心，使中等大小的细胞器沉降，沉淀中包含线粒体、溶酶体和过氧化物酶体；将第二次离心的上清液再用更高的速度（～100000×g）离心，使小的细胞器如微粒体、内质网、高尔基体和质膜沉淀，上清液中剩下胞质溶胶的有关成分。细胞器在每一步离心沉淀中的分布可随离心速度和时间的不同而有一定差别。一般说来，用差速离心分离的细胞器不是很纯的，要获得比较纯的细胞器必须把初步分离的细胞器进一步纯化。 （3）细胞器的纯化 可采用不同的方法进一步将初步分离的细胞器纯化。如线粒体、溶酶体和过氧化物酶体虽然大小相近，但密度不同，可用等密度离心进一步分离；细胞核部分则可用高密度蔗糖溶液（2.0mol/L）的差速离心法来纯化。对分离细胞器纯度的鉴别主要有两种方法：一种是电镜作形态鉴别；另一种方法是生化分析，因为已知每种细胞器都含有某些特殊的分子，可作为标志用于鉴定细胞器（表2-1）。 细胞器 标志分子(标志酶) 细胞核 NAD合成酶、DNA聚合酶 线粒体 细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶 溶酶体 酸性磷酸酶、酸性脱氧核糖核酸酶 过氧化物酶体 过氧化氢酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶 内质网 葡萄糖-6-磷酸酶、酯酶、细胞色素P450 高尔基体 核苷二磷酸酶、β-半乳糖苷转移酶 质膜 5’-核苷酸酶、碱性磷酸二酯酶 胞质溶胶 糖酵解的酶类、磷酸葡萄糖变位酶 细胞器分离纯化后，一方面可对细胞器的化学组成、酶活性和代谢特点进行分析，另一方面可将分离的细胞器在体外进行该细胞器的功能实验，称为无细胞系统( cell free system )实验。目前有关细胞器结构与功能以及细胞中的重要反应过程的资料，如蛋白质合成机制、蛋白质分选和运输等，有不少来自分离细胞器的生化分析和无细胞系统实验。 第四节 分析细胞学技术 分析细胞学是从定量的角度对细胞的各种形态学参数、生物学特征、细胞生化成分的组成及含量以及细胞的各种功能等进行研究，将以往各种细胞学技术从定性、定位进一步发展到定量的研究，获得定量的测量数据，以更客观地揭示生命活动的规律。分析细胞学技术的发展有两个主要领域，固定式细胞分析和流动式细胞分析。固定式细胞分析是指细胞样品固定在载玻片或培养皿上，通过显微镜，由成像系统获取图像，定量分析细胞的形态学参数和细胞内一些生化成分的含量。常用仪器有显微分光光度计、图像分析系统和激光扫描共聚焦显微镜。流动式细胞分析要求将细胞样品悬浮在液体中，这些细胞悬液加入仪器后，高速度地流过仪器的检测区，仪器检测悬液中每一个细胞，并进行分析测定，记录每一个细胞众多的生物学参数，并可根据预选的条件将其中特殊的细胞亚群分选纯化出来，以供进一步的深入研究，这类仪器统称为流式细胞仪。以下对流式细胞分析技术、显微分光光度计和图像分析系统作简要介绍。激光扫描共聚焦显微镜已在显微镜技术一节介绍。 一、流式细胞分析技术 流式细胞仪（flow cytometer，FCM ）从原理上讲是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪，它是结合激光技术、光电测量技术、数字计算机技术和荧光细胞化学技术的产物，是分析细胞学领域的重要仪器。流式细胞术是一种对悬液中单个细胞或细胞器进行高速测量和自动分析的测量技术，每秒能测量数万个细胞并多参数检测，还能在分析的同时分选出有指定特征的细胞。 （一）流式细胞仪的结构与原理 流式细胞仪的一般结构可分为三个部分，细胞流动室和液流驱动系统；激发光源及其光束成形系统；细胞信号检测和分析系统（图2－10）。这三部分在仪器中一般按三个互为垂直的轴线安置，即X轴方向的激发光轴线、Y轴方向的细胞荧光信号检测轴线和 Z轴方向的细胞流轴线。此三个轴线的交点即为仪器的细胞信号检测区。样品中的每一个细胞必须按顺序依次以相同的速度和轨迹通过此检测区。每一细胞沿Z轴流经检测区时，受到激发光照射。细胞受光照时产生细胞的散射光信号与荧光信号，这些细胞信号由检测器收集，经计算机软件分析处理，这就是流式细胞分析。 流动室是流式细胞仪的核心部件，它采用液体动力学分层鞘流技术，层流技术保证样品中的每一细胞都沿流动室的中心轴运动，实现了每一细胞以相同的速度、相同方向、相同的轨迹逐个依次通过检测区，流动室也可称为单细胞流发生器。激光是一种单色性、方向性、相干性好的高强度光源，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。流式细胞仪的激发光源通常采用有多条可调谐的输出谱线的氩离子气体激光器，它能与多种荧光染料激发谱匹配。在实际应用时，一般采用单谱线488波长作为激发光源。检测器采用多通道光电倍增管，由数字显示器和示波器实时显示各种信号波形及数据参数，结果由计算机分析处理。 流式细胞仪分选装置一般由超声振动器、液滴充电电路、静电高压偏转场等组成。细胞分选是在细胞分析的基础上进行的，经确认需要分选的细胞，在该细胞到达液流断离端的即刻，由液滴充电电路发出一个充电脉冲，保证该包含有要分选细胞的液滴断离后带有静电荷。带电液滴向下运动经过高压偏转电场时，在静电力的作用下偏离原运动轨迹。带正电荷的液滴偏向负极，带负电荷的液滴偏向正极。静电高压值一般是固定的，调节充电脉冲幅度，改变液滴荷电多少，可改变充电液滴的偏转角和偏转距离。分选所得的细胞可以用玻片、试管、96孔板等进行收集,结合分选后的细胞培养、细胞形态学观察、细胞图像分析等结果，可以综合单个细胞的更多信息，这是其他细胞学技术难以实现的。 流式细胞仪中被测样品的细胞，流经仪器检测区时受到激发光的照射，激发光与细胞相互作用后可产生散射光信号和荧光信号。散射光信号是指激发光与细胞相遇作用后反射、折射、衍射等综合的结果，它能反映细胞群体及其不同亚群形态学的一些信息，并且不依赖细胞样品的荧光染色过程。荧光信号主要是指经过特异荧光染色后细胞受照发射的荧光信号。各种特异荧光染色方法是针对细胞内各种不同的生化成分或各种特异抗原等设计的。每一种荧光染色方法中必须用到一种或多种的荧光染料。由于每一种荧光分子结构不同，考虑荧光激发谱与荧光发射谱的接受时，通常要注意选择合适的激发光源和各类分束滤色片。流式细胞术为了保证获得准确的测试分析结果必须进行必要的质量控制，选用标准荧光微球和固定的鸡血细胞是最常用的仪器参考标准。 (责任编辑：laiquliu) |
