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一．细胞培养的基本知识 （一）培养细胞的类型及其特点 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。 1．贴附型 大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。 正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。 2．悬浮型 少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。 （二）培养细胞的增殖过程 1．培养细胞一代的增殖过程 培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存 空间相对孤立，营养是有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（passage 或subculture）。从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是细胞培养一代与细胞倍增（doubling）的概念是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增2-6次。细胞传一代以后，细胞群体一般要经过潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种后呈悬浮状态，在0.5-4 h内贴附于支持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24 h。随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细胞群体进入指数增长期，此期又称对数期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适于进行实验研究；此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入指数增长 2．培养细胞的生命期（life span） 培养细胞的生命期指的是细胞在培养中持续增殖 和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。从体内取出细胞接种培养到第一次传代叫原代培养，一般持续1-4周。原代细胞一经传代后便称为细胞系（cell line），进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体的核型。一般情况下可传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。肿瘤细胞系可无限增殖而无衰退期，正常细胞系也可在传代期末期或衰退期发生自发转化，细胞获得永生性即永久增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。 3．培养细胞的生存条件 培养细胞需要特定的培养基和培养设备。 （1）培养基 培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。细胞在体外生存于含各种营养成分的培养基中。培养基的种类很多，按其物质状态，分半固体培养基（如软琼脂培养基）和液体培养基两类，其中液体培养基（即培养液）使用最为广泛。用各种合成培养基配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和不同研究目的。一般情况下需添加10～20％的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度，称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，加2～5％血清含量即可，称为维持培养液。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素100μg/ml）。 （2） 细胞培养设备 培养细胞在培养器皿中生长，浸浴于培养液，并需要特有的环境，包括一定的温度、湿度和气体成分。培养器皿主要有碟和瓶两类，材质为玻璃或塑料，现在使用一次性的塑料培养器皿日益普及。培养环境通常由CO2恒温孵育箱提供，恒定地提供37C温度、95％湿度和一定量的CO2（通常为5%），CO2可使培养液维持稳定的pH。 另外，细胞培养过程中进行换液、传代等工作时需在无菌工作台上进行。 二．细胞培养的基本技术 （一）细胞分离和原代培养 原代培养也叫初代培养，指从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。 培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用低速离心法分离。培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用胰蛋白酶或胶原酶消化法使组织进一步分散，以获得细胞悬液。 （二）培养细胞的传代 细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离培养称之为传一代。 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。 贴壁细胞的消化传代多用混合了胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）的消化液消化传代。EDTA能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。消化液使细胞脱落形成细胞悬液，然后以合适比例接种在新的培养瓶内。 悬浮细胞的传代可直接添加新鲜培养液，或离心收集后换新鲜培养液，以一定比例稀释传代。 （三）细胞的冻存和复苏 培养细胞在传代中性质易发生改变, 有支原体污染的危险。研究工作也要求细胞株的代数应维持在一定期限内。解决这些困难的方法就是将细胞冻存，需要的时候再行复苏。冻存前需向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），以减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”。细胞冻存在液氮中，从理论上讲贮存时间是无限的。 （四） 细胞培养微生物污染的检测 细胞培养过程中操作不当时，易引发微生物污染，主要污染微生物为霉菌、细菌和支原体。可用多种手段明确污染性质，从而从源头上杜绝污染。然而微生物污染一旦发生，多数无法救治。为了防止污染的蔓延，应及时丢弃污染细胞。 第六节 细胞工程技术 广义的细胞工程（cell engineering）指所有应用于生物学和医学的、以细胞为操作对象的技术手段，其中也包括细胞培养。一般地说，细胞工程主要指应用各种手段对细胞不同结构层次(整体、细胞器、核、基因等)进行改造，如进行细胞融合、核移植、基因转移等，以获得具有特定生物学特性的细胞。 一．细胞融合技术 在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程，即为细胞融合（cell fusion）。通过细胞融合，可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一个合核体的杂种细胞。 细胞在生长过程中，可能发生自发的融合，但几率很低。在实际工作中常采用各种促融合手段，包括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇（PEG）及电激融合法等。在进行细胞融合反应和适当时间的培养后，需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。 细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术。细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆抗体技术的成功。 1975年Koehler和Milstein将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞，即既能在培养条件下长期生长增殖，又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的B淋巴细胞杂交瘤。对这种融合细胞进行克隆化以后，即可获得来自同一细胞克隆的抗体，这种抗体具有高度的均一性，称为单克隆抗体 。 二．核移植技术 细胞核移植（nuclear transfer）是指将一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体，并能发育为与供核细胞基因型相同的后代，因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊“多利”就是体细胞核移植技术的产物。 核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。将获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙后，施加微电流脉冲，使核质融合，形成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物输卵管内孵育，经过一段时间的培养，有的动物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受体子宫里。 实际上，胚胎细胞核移植技术的应用已有半个世纪的历史，德国科学家Spemann于1938年最先提出并进行了两栖类动物细胞核移植试验。中国学者童第周于1963年在世界上首次报道了将金鱼等鱼的囊胚细胞核移入去核未受精卵内，获得了正常的胚胎和幼鱼。 体细胞核移植也在上世纪六十年代在非洲爪蟾获得成功。1997年英国罗斯林研究所Wilmut首次报道以高度分化的成年母羊乳腺细胞为核供体克隆出小羊“多利”。“多利”的诞生在理论上具有重要意义，说明高等动物高度分化的成体动物细胞核仍具有发育的全能性。目前，通过体细胞核移植获得的“克隆鼠”、“克隆牛”等均已面世。 三． 基因转移技术 基因转移（gene transfer）指向受体细胞中导入外源基因，是改造细胞遗传性状的常用手段。一般情况下，能稳定接纳外源基因的细胞只有受体细胞总数的千分之几。因此为了快速有效地筛选转化细胞，一般在转入基因中携带有特定的选择标记，目前应用较多的为细胞抗药性筛选，如根据新霉素抗性基因进行筛选。基因转移又常称为基因转染（gene transfection）。 1． 物理学方法 包括电穿孔、显微注射、裸露DNA直接注射。 电穿孔法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米大小的微孔，使外源DNA转移到细胞中。该方法较为简单，广泛应用于培养细胞的基因转移。 显微注射法主要用于制备转基因动物。该法的基本操作程序是：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后从雌鼠输卵管内取出受精卵；借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄性原核内；将注射了基因的受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，繁殖产生转基因小鼠。该方法转入的基因随机整合在染色体DNA上，有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变。 裸露DNA直接注射法是最简单的基因转移方法。将裸露DNA直接注射到组织后，DNA有可能直接被细胞所摄入。外源基因进入细胞的效率与局部组织或细胞的损伤程度有关，基因在体内的表达时间与机体的免疫功能有关。 2．化学方法 基因转移的化学方法包括DEAE－葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体法等，是通过增加细胞膜的通透性、增加胞吞或胞饮、增加DNA与细胞的吸附等机理而实现基因转移的。这些方法多用于培养细胞的基因转移。 DEAE－葡聚糖法将外源DNA片段与DEAE－葡聚糖等高分子碳水化合物混合，形成的含DNA的大颗粒黏附于受体细胞表面，通过其胞饮作用进入细胞内。这种方法的转染效率较低。磷酸钙共沉淀法是使待转化的DNA与磷酸钙共沉淀形成大颗粒，颗粒悬液与细胞一起孵育，颗粒通过胞饮作用进入细胞。该方法转染效率至少是DEAE－葡聚糖法的100倍。脂质体（lipofectin）法令脂质体试剂与DNA作用将DNA分子包入其囊状结构中，携带了DNA的脂质体可与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质和细胞核内。该方法基因转移效率很高。 3．生物学方法 基因转移的生物学方法主要指病毒介导的基因转移。根据受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转染载体。目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、猴肿瘤病毒载体、牛痘病毒载体）、反转录病毒载体等。用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒，感染细胞后仅能将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗粒。这种方法的缺点是：所有的病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应；都或多或少地存在一定的安全隐患；而且转导能力有限、不适于大规模生产。（易静、朱平、胡庆沈、高飞） (责任编辑：laiquliu) |
